Ảnh hưỞng của môi trưỜng nuôi cấy không sử DỤng chấT ĐIỀu hòa sinh trưỜng lên khả NĂng tăng sinh khối và XÁC ĐỊnh dư LƯỢng nitrat, kim loại nặng có trong mẫu cây lan gấM



tải về 0.54 Mb.
Chuyển đổi dữ liệu15.11.2017
Kích0.54 Mb.
#1813

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỜNG LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH KHỐI VÀ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NITRAT, KIM LOẠI NẶNG CÓ TRONG MẪU CÂY LAN GẤM (Anoectochilus formosanus Hayata)

Đỗ Đăng Giáp*, Đỗ Đức Thăng, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Thị Huyền Trang, Đỗ Thị Tuyến



Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

*Email: dodanggiap@gmail.com

TÓM TẮT

Trong báo cáo này, vai trò của các loại môi trường khoáng (Murashige và Skoog, Knudson C, Dr Alan Cooper và Albert’s) không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh sinh khối cây Anoectochilus formosanus Hayata được khảo sát. Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường Albert’s thích hợp nhất cho sự nhân nhanh sinh khối cây A. formosanus Hayata, tạo cây hoàn chỉnh với bộ lá và rễ phát triển tốt, chiều cao cây 10,13 cm; khối lượng tươi 2,43 g/cây và khối lượng khô 0,3 g/cây. Chồi cây A. formosanus Hayata được nuôi cấy ở điều kiện nuôi cấy khác nhau là rắn, rắn và lỏng kết hợp, lỏng tĩnh, lỏng lắc. Hệ số nhân nhanh sinh khối cao nhất đạt được ở điều kiện nuôi cấy lỏng lắc. Kết quả phân tích dư lượng NO3-, kim loại nặng Cu và Zn trong sinh khối cây A. formosanus Hayata đều nằm trong ngưỡng cho phép sử dụng theo tiêu chuẩn đối với sản phẩm rau, quả cho thấy sinh khối thu nhận từ quá trình nuôi cấy an toàn cho sức khỏe con người.

Từ khóa: Albert’s, Anoectochilus formosanus Hayata, kim loại nặng, môi trường khoáng, nuôi cấy lỏng.

GIỚI THIỆU

Cây lan gấm là tên gọi chung cho bốn chi: Ludisia, Anoectochilus, Goodyera, Macodes, thuộc họ Orchidaceae với trên 50 loài khác nhau [20]. Trong đó chi Anoectochilus có số loài phong phú nhất (30 - 40 loài). Loài lan gấm có giá trị dược liệu cao và được thương mại cao nhất thế giới hiện nay là A. formosanus Hayata có nguồn gốc từ Đài Loan [17]. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu về y học của thế giới thì cây lan gấm đã được công nhận là cây thuốc có chứa thành phần các hợp chất có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính và có tính kháng khuẩn. Cây A. formosanus tươi hoặc khô đun sôi trong nước có tác dụng điều trị đau ngực và đau bụng [11], bệnh tiểu đường, viêm thận [4], sốt, tăng huyết áp, liệt dương, rối loạn gan, lá lách và đau phế mạc [12], cây tươi được dùng trong điều trị rắn cắn [12]. Việc đưa lan gấm vào sử dụng điều trị cho những bệnh nhân mắc ung thư đã được áp dụng từ lâu. Vì những giá trị dược lý như trên đặt ra nhu cầu lớn về nguồn nguyên liệu an toàn và chất lượng phục vụ chăm sóc sức khỏe con người. Việc nhân nhanh sinh khối trong điều kiện in vitro, không sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật với môi trường nuôi cấy được kiển soát có thể được xem là giải pháp cho việc tạo sinh khối an toàn với số lượng lớn và chủ động.

Vai trò của môi trường khoáng lên sự tăng trưởng của thực vật trong nuôi cấy mô đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Môi trường nuôi cấy là yếu tố chính quyết định hiệu quả, sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. Thành phần môi trường khoáng thích hợp với từng đối tượng nghiên cứu tuỳ vào nhu cầu dinh dưỡng của loài thực vật đó. Môi trường dinh dưỡng cũng có vai trò quyết định thành phần các chất tích luỹ trong mẫu cấy. Trong nuôi cấy in vitro, trạng thái môi trường nuôi cấy cũng có tác động tích cực hoặc hạn chế sự phát triển của mẫu cấy tuỳ vào từng đối tượng và loại mô cấy được sử dụng. Trạng thái môi trường rắn thường được sử dụng trong nuôi cấy mô. Ngày nay, nuôi cấy trên môi trường lỏng đang được chú ý nghiên cứu bởi dễ dàng mở rộng được quy mô sản xuất, kiểm soát môi trường và áp dụng tự động hóa. Ứng dụng môi trường lỏng trong nuôi cấy cũng đã được báo cáo để nhân nhanh chồi các dòng mía cao sản và đã giảm được chi phí nhân giống [15].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên vật liệu

Vật liệu dùng trong thí nghiệm là chồi của cây A. formosanus Hayata nuôi cấy in vitro đạt chiều cao 2,5 ˗ 3,0 cm tại phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia phía Nam về Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới.



Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 2°C, thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày, cường độ ánh sáng: 26,20 µmol m-2s-1 và độ ẩm phòng nuôi cấy: 55 ˗ 60%.



Phương pháp nghiên cứu

Bố trí thí nghiệm

Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng sinh khối cây A. formosanus Hayata không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Mô tả thí nghiệm: Mẫu cấy được nuôi cấy trong các hộp sigma có chứa 50 ml môi trường rắn và 30 ml môi trường lỏng là các loại môi trường khác nhau gồm: Murashige và Skoog [19], Knudson C [14], Dr Alan Cooper [5], Albert’s [23]. Mỗi nghiệm thức cấy 5 hộp, mỗi hộp 10 mẫu, thí nghiệm lặp lại ba lần và bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.

Xác định dư lượng NO3-, kim loại nặng Cu và Zn có trong sinh khối cây Anoectochilus formosanus Hayata nuôi cấy in vitro

Mô tả thí nghiệm: Mẫu cây A. formosanus Hayata nuôi cấy trên các môi trường khoáng khác nhau được thu nhận và sấy khô đến khối lượng không đổi. Sau đó mỗi mẫu với mỗi chỉ tiêu cân 0,5 g để sử dụng làm nguyên liệu xác định dư lượng các khoáng chất NO3-, kim loại nặng Cu, Zn có trong mẫu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần đối với mẫu cấy trên mỗi môi trường khoáng khác nhau.

Khảo sát ảnh hưởng của trạng thái môi trường nuôi cấy lên sự tăng sinh khối cây A. formosanus Hayata trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Mô tả thí nghiệm: Mẫu cấy được nuôi cấy trong hộp sigma bổ sung 80 ml môi trường Albert’s với các trạng thái môi trường rắn, rắn và lỏng kết hợp, lỏng tĩnh và lỏng lắc với tốc độ 100 vòng/phút. Mỗi hộp cấy 10 mẫu, mỗi nghiệm thức cấy 5 hộp, thí nghiệm được lặp lại ba lần và bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.

Các phương pháp lấy chỉ tiêu

Phân tích hàm lượng NO3: Mẫu được sấy khô, nghiền nhỏ sau đó cân 500 mg cho vào ống Kjeldahl. Thêm 3,5 ml H2O2 đun ở nhiệt độ thấp (80oC) trong 1 giờ. Để nguội sau đó thêm 3 ml H2SO4 (d = 1,84) và đun ở nhiệt độ 360oC trong 1 giờ (lập lại cho tới khi mẫu có màu trắng), để nguội và thêm nước cất định mức dung dịch mẫu đến 15 ml [13]. Sau đó phân tích mẫu theo bộ kít của máy SpectroDirect.

Phân tích hàm lượng Cu và Zn: Mẫu được sấy khô, nghiền nhỏ sau đó cân 500 mg cho vào ống Kjeldahl, thêm 5 ml H2SO4 để qua đêm. Tiếp theo đun sôi ở nhiệt độ 400oC trong 3 giờ. Để nguội sau đó thêm 1 đến 2 giọt HClO4 và đun ở nhiệt độ 400oC cho tới khi mẫu có màu trắng, để nguội và thêm nước cất định mức dung dịch mẫu đến 15 ml [13]. Sau đó phân tích mẫu theo bộ kít của máy SpectroDirect.

Xử lý số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi ghi nhận sau 8 tuần: Khối lượng tươi (g/mẫu), khối lượng khô (g/mẫu), chiều cao cây (cm), độ mở lá, diện tích lá (cm2), số lá (lá /mẫu), số rễ (rễ /mẫu), chiều dài rễ (cm). Hàm lượng khoáng chất NO3- và kim loại nặng (Cu, Zn) có trong mẫu (mg/kg tươi) được thu thập và xử lý bằng phần mềm SPSS bản 22 theo phương pháp LSD - Least Significant Difference ở mức ý nghĩa 5% [10].



KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự tăng sinh khối cây A. formosanus Hayata trên môi trường lỏng không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường. Thành phần môi trường thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Nhằm hướng đến việc tạo nguồn sinh khối lớn, an toàn cho người sử dụng, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các loại môi trường khoáng nuôi cấy khác nhau và không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho sự tăng sinh khối cây A. formosanus Hayata.



Bảng 1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng tăng sinh khối của cây A. formosanus Hayata

Nghiệm thức

Môi trường khoáng

Chiều cao cây (cm)

Khối lượng tươi (g)

Khối lượng khô (g)

ĐC

MS rắn

7,39c

1,21c

0,13e

MS

MS lỏng

9,67ab

2,33a

0,27b

A

Albert’s

10,13a

2,43a

0,30a

D

Dr Alan Cooper

9,11b

1,83b

0,23c

K

Knudson C

7,21c

1,23c

0,15d

Các mẫu ký tự khác nhau (a,b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 bằng phép thử LSD

Các loại môi trường khoáng được sử dụng để khảo sát trong thí nghiệm có sự khác nhau về hàm lượng khoáng đa lượng và vi lượng, bao gồm các môi trường giàu dinh dưỡng như môi trường MS, Dr Alan Cooper, Albert’s và môi trường nghèo dinh dưỡng như Knudson C. Kết quả thu nhận cho thấy các chỉ tiêu có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa các nghiệm thức có hàm lượng khoáng khác nhau (bảng 1, 2). Chồi cây A. formosanus Hayata được nuôi cấy trên môi trường Albert’s đạt chiều cao cây (10,13 cm), khối lượng tươi (2,43 g/cây) và khối lượng khô (0,30 g/cây) cao hơn so với các môi trường còn lại.



Bảng 2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng tăng sinh khối của cây A. formosanus Hayata (tt)

Nghiệm thức

Môi trường khoáng

Độ mở lá

Diện tích lá (cm2)

Số lá

Số rễ

Chiều dài rễ (cm)

ĐC

MS rắn

0,73d

0,66e

4,10b

3,97

3,71b

MS

MS

0,79c

3,02b

5,67a

4,33

3,73b

A

Albert’s

1.00a

3,91a

5,70a

4,27

3,99a

D

Dr Alan Cooper

0,88b

2,16c

5,57a

4,30

3,51b

K

Knudson C

0,91b

1,19d

4,53b

4,07

4,14a

Các mẫu ký tự khác nhau (a,b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 bằng phép thử LSD

Trong nuôi cấy mô thực vật, mẫu cấy sau khi cắt ra và được đặt vào môi trường dinh dưỡng, các tế bào bị tổn thương ở vùng cắt hay do thao tác kỹ thuật sẽ phóng thích các ion và cation ra môi trường đặc biệt là cation kim loại (Na+, Ca2+, K+, Mg2+) trong 1 ˗ 2 ngày đầu tiên sau khi cấy, do đó nồng độ ion và cation trong mô thực vật thực sự bị giảm [3]. Các tế bào sau đó bắt đầu hấp thu tích cực ion và cation làm cho nồng độ bên trong tế bào từ từ tăng lên. Phosphate và nitơ (đặc biệt là amoni) được hấp thu nhanh hơn so với các ion khác. Trong môi trường lỏng, gần như tất cả các P và NH4+ được vận chuyển lên trong hai tuần đầu tiên sau nuôi cấy. Sau khi hấp thu, P được phân phối lại cho các mô được hình thành sau hai tuần đầu tiên, do đó, trong các môi trường giàu dinh dưỡng sẽ giúp cho tế bào phát triển tốt hơn. Mẫu cấy có nhu cầu cần một lượng nitơ và kali lớn để kích thích sản xuất các protein mới sau khi chuyển vào môi trường nuôi cấy [9]. Trong nghiên cứu này, chồi cây A. formosanus Hayata nuôi cấy trong môi trường Albert’s, MS và Dr Alan Cooper là các môi trường có hàm lượng dinh dưỡng cao cho nên các cây phát triển tốt hơn hẳn so với môi trường Knudson C. Trong đó, môi trường Albert’s đạt kết quả tốt nhất ở tất cả các chỉ tiêu (bảng 1, 2). Hơn nữa, các cây trên môi trường này đều mở lá hoàn toàn (độ mở lá là 1,00), cây khỏe mạnh, thân to có màu xanh tím đặc trưng của giống này. Ở các chỉ tiêu chiều cao chồi, khối lượng tươi, số lá và số rễ của mẫu cấy trên môi trường MS và Albert’s là không có sự khác biệt về mặt thống kê. Nhưng các mẫu cấy trên môi trường MS có hình thái lá cuộn lại chứ không mở xoè ra, độ mở lá chỉ đạt 0,79. Một số mẫu cấy được nuôi cấy trên môi trường MS có hiện tượng đa chồi. Với mục đích trong nghiên cứu này nhằm tạo ra cây hoàn chỉnh đạt chất lượng cao để thu sinh khối cho nên chúng tôi chọn môi trường Albert’s là môi trường tối ưu cho việc tạo cây con hoàn chỉnh.

Xác định dư lượng NO3-, kim lọai nặng Cu và Zn có trong sinh khối cây Anoectochilus formosanus Hayata nuôi cấy in vitro

Vào những năm 1945, nitrat (NO3-) lần đầu được phát hiện như là dạng độc chất tồn dư trong nông sản, gây hại cho sức khỏe con người. Mặc dù nitrat không độc với thực vật nhưng nếu sản phẩm nông sản được người sử dụng có dư lượng nitrat cao đặc biệt là bộ phận lá sẽ gây hại cho sức khỏe của người tiêu dùng. Khi xâm nhập vào cơ thể con người với liều cao, dưới tác động của các enzyme trong cơ thể, nitrat chuyển hóa thành nitrit, ngăn cản việc hình thành và trao đổi oxy của hemoglobine trong máu, dẫn đến tình trạng thiếu oxy của tế bào (ngộ độc nitrat). Nitrat đặc biệt nguy hại đối với cơ thể trẻ em. Ngoài ra nitrit trong cơ thể con là nguồn tạo ra các nitrosamine là yếu tố gây ung thư. Mặt khác, trong cơ thể người, do sự khử nitrat nhanh hơn sự chuyển đổi nitrit thành ammonia, nitrit nhanh chóng bị tích tụ, gây bệnh Methemoglobinemia, làm mất khả năng vận chuyển oxy trong máu, đồng thời hạ huyết áp. Nitrit khống chế sự sinh sản của một số vi khuẩn hiếu khí, yếm khí và ở nồng độ cao cũng có thể gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe sinh sản và tăng nguy cơ sẩy thai ở người. Vì vậy, nitrat trong rau, củ, quả có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, do đó nó luôn được xem là một trong những tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng rau quả.



Bảng 3 Dư lượng NO3-, Cu và Zn trong sinh khối cây A. formosanus Hayata

Nghiệm thức

NO3-

(mg/kg tươi)

Cu

(mg/kg tươi)

Zn

(mg/kg tươi)

MS-DC

45,38b

9,06a

0,03a

MS-L

48,82b

8,38c

0,03a

A

54,06b

8,51bc

0,06a

D

56,87b

8,92ab

0,02a

K

72,30a

8,59abc

0,00a

Các mẫu ký tự khác nhau (a,b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 bằng phép thử LSD

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, đa số các loại môi trường nuôi cấy phổ biến được sử dụng thường có mặt các muối nitrat. Vì vậy, việc phân tích dư lượng nitrat trong mẫu thực vật nuôi cấy mô được đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, đặc biệt là đối với các quy trình nghiên cứu nuôi cấy cây dược liệu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành kiểm tra dư lượng của nitrate có trong mẫu cây A. formosanus Hayata nuôi cấy mô, kết quả cho thấy hàm lượng nitrate trong mẫu cấy trên môi trường Knudson C là cao nhất đạt 72,30 mg/kg tươi. Đối với mẫu cấy trên các môi trường khác, hàm lượng NO3 đều dưới mức 57,00 mg/kg tươi. Theo tiêu chuẩn của tổ chức y tế thế giới (WHO) và cộng đồng kinh tế châu Âu (EU) giới hạn hàm lượng NO3 (mg/kg sản phẩm) cho phép trên một số loại rau trong khoảng 400 ˗ 1500 mg/kg tươi và một số loại quả trong khoảng 60 ˗ 400 mg/kg tươi [21]. Như vậy, sinh khối A. formosanus Hayata in vitro được nuôi cấy trên các môi trường khảo sát đều có hàm lượng nitrat nằm dưới mức tiêu chuẩn được cho phép nên sinh khối thực sự an toàn đối với sức khỏe người tiêu dùng về dư lượng nitrat.



Đối với con người, có khoảng 12 nguyên tố kim loại nặng gây độc như: Chì, thủy ngân, nhôm, arsenic, cadmium, nickel, … Một số kim loại nặng được tìm thấy trong cơ thể và thiết yếu cho sức khỏe con người, chẳng hạn như: Sắt, kẽm, magnesium, cobalt, manganese, molybdenum và đồng mặc dù cơ thể sử dựng với lượng rất ít nhưng chúng hiện diện và có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên, ở mức thừa của các nguyên tố kim loại thiết yếu có thể gây hại cho sức khỏe. Nếu lượng kim loại nặng đi vào cơ thể và tích lũy bên trong tế bào lớn hơn sự phân giải chúng thì chúng sẽ tăng dần và sự ngộ độc sẽ xuất hiện. Do vậy, con người bị ngộ độc không những với hàm lượng cao của kim loại nặng mà cả khi với hàm lượng thấp và thời gian kéo dài sẽ đạt đến hàm lượng gây độc, gây ra nhiều bệnh cấp tính và mãn tính nghiêm trọng. Theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế về giới hạn tối đa thành phần kim loại nặng đối với sản phẩm rau, quả tươi thì hạn mức quy định với hàm lượng Cu cho phép trong sản phẩm là < 30 mg/kg tươi và hàm lượng Zn là < 40 mg/kg tươi [2]. Trong nghiên cứu này, dư lượng Cu và Zn trong cây A. formosanus Hayata cũng được kiểm tra, kết quả phân tích các mẫu cấy trên tất cả môi trường trong nghiên cứu thì hàm lượng Cu trong mẫu cao nhất trên môi trường MS rắn là 9,06 mg/kg tươi và hàm lượng Zn cao nhất trên môi trường Albert’s là 0,06 mg/kg tươi, cả hai hàm lượng Cu và Zn đều thấp hơn so với quy định. Do đó, qua kết quả thí nghiệm này cho thấy việc ứng dụng nuôi cấy mô với các môi trường đã khảo sát để sản xuất sinh khối A. formosanus Hayata cho sản phẩm an toàn về dư lượng NO3- và các kim lọai nặng Cu, Zn.

Khảo sát ảnh hưởng của trạng thái môi trường nuôi cấy lên sự tăng sinh khối cây A. formosanus Hayata trong môi trường lỏng không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Sự phát triển của thực vật trong nuôi cấy in vitro phụ thuộc vào mẫu cấy và sự tương tác giữa mẫu cấy và môi trường. Bên cạnh, phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch thông thường, một số nghiên cứu cho rằng môi trường nuôi cấy lỏng là lý tưởng cho vi nhân giống vì nó làm giảm chi phí sản xuất và thích hợp để tự động hóa [1]. Các hệ thống nuôi cấy lỏng cung cấp sự thống nhất về các điều kiện nuôi cấy và có thể được thay đổi một cách dễ dàng. Hơn nữa, trong môi trường lỏng cho phép mô thực vật tiếp xúc trực tiếp với môi trường, tạo điều kiện cho mô hấp thu các chất dinh dưỡng cao qua đó kích thích sự phát triển của chồi và rễ. Trong thí nghiệm này, trạng thái môi trường có sự kết hợp của cả môi trường rắn và lỏng đã được thực hiện. Bên cạnh đó các trạng thái môi trường khác bao gồm: rắn, lỏng tĩnh và lỏng lắc với tốc độ 100 vòng/phút cũng được khảo sát đánh giá tác động của trạng thái nuôi cấy lên khả năng tăng sinh khối cây A. formosanus Hayata nuôi cấy in vitro. Kết quả ghi nhận sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện ở bảng 4.



Kết quả từ bảng 4 cho thấy, cây A. formosanus Hayata được nuôi cấy ở điều kiện lỏng lắc có các chỉ tiêu tăng trưởng như chiều cao cây, diện tích lá, khối lượng tươi đạt cao nhất và cao hơn hẳn so với các nghiệm thức khác. Chỉ tiêu khối lượng khô ở nghiệm thức này không có khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức trạng thái môi trường rắn ˗ lỏng kết hợp và cao hơn các nghiệm thức khac. Số lá hình thành ở nghiệm thức này tuy thấp hơn các nghiệm thức còn lại nhưng lá hình thành có diện tích lớn nhất, lá to và mở hoàn toàn, có màu sắc đặc trương của giống A. formosanus Hayata. Số rễ hình thành và chiều dài rễ ở nghiệm thức lỏng lắc thấp nhất trong thí nghiệm nhưng các rễ hình thành nhiều lông rễ. Điều này có thể được giải thích vì trong môi trường lỏng lắc các chất dinh dưỡng phân bố đồng đều, môi trường lỏng cũng tạo điều kiện dễ dàng hơn trong hấp thu dinh dưỡng so với môi trường rắn, do đó hệ rễ của các mẫu nuôi cấy ở điều kiện lỏng lắc không cần kéo dài mà hình thành nhiều lông rễ để tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng. Tương ứng với lý giải này, nghiệm thức có trạng thái môi trường nuôi cấy rắn có số rễ và chiều dài rễ lớn hơn nghiệm thức lỏng lắc, song chiều cao cây và khối lượng cây đều có giá trị thấp nhất so với các nghiệm thức còn lại. Trạng thái môi trường rắn kết hợp lỏng đã giúp gia tăng hiệu quả nhân sinh khối cây A. formosanus Hayata thể hiện qua kết quả của các chỉ tiêu chiều cao chồi, khối lượng, số rễ và chiều dài rễ tăng so với môi trường rắn. Trạng thái lỏng tĩnh cũng cho kết quả cao hơn nghiệm thức sử dụng môi trường rắn nhưng các chỉ tiêu chiều cao chồi, khối lượng vẫn thấp hơn nghiệm thức nuôi cấy lỏng lắc.

Bảng 4 Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên khả năng tăng sinh khối của cây A. formosanus Hayata

Nghiệm thức

Chiều cao (cm)

Số lá

Diện tích lá (cm2)

Khối lượng tươi (g)

Khối lượng khô (g)

Số rễ

Chiều dài rễ (cm)

Rắn

9,00c

6,06a

3,91b

1,72c

0,19b

3,36b

2,58b

Rắn – Lỏng

10,13bc

5,70a

4,52a

2,43ab

0,30a

4,26a

3,99a

Lỏng Tĩnh

10,59b

5,10b

3,86b

2,23b

0,17b

4,16a

1,91c

Lỏng Lắc

13,11a

4,50c

4,63a

2,62a

0,28a

2,83b

1,23d

Các mẫu ký tự khác nhau (a,b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P ≤ 0,05 bằng phép thử LSD

Cây A. formosanus Hayata phát triển tốt trong môi trường lỏng có thể là do trong môi trường rắn mẫu cấy hấp thu các chất dinh dưỡng chậm dẫn đến lượng dinh dưỡng trong cây thấp và do đó làm giảm tốc độ tăng trưởng của cây [22]. Debergh,1983 và George, 1993 đã cho rằng lượng nước trong môi trường thạch ˗ rắn thấp khiến cho sự hấp thụ bởi thực vật thấp hơn so với môi trường lỏng [6], [8]. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Mbiyu và cộng sự, 2011 trên đối tượng cây khoai tây (Solanum tuberosum L.), sự tăng trưởng của cây khoai tây được khảo sát trên môi trưởng lỏng và rắn. Kết quả nghiên cứu của Mbiyu đã cho thấy các chỉ tiêu tăng trưởng của cây và sự phát sinh thêm chồi đạt cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường lỏng [18]. Năm 2007, Lin và cộng sự đã nghiên cứu sự nhân nhanh chồi cây Bambusa oldhamii Munro trên môi trường bán rắn, lỏng và lỏng lắc. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy trên môi trường lỏng và lỏng lắc chồi cây Bambusa oldhamii Munro có hệ số nhân nhanh chồi cao nhất [16].

Trong nghiên cứu này cũng cho thấy cây A. formosanus Hayata được nuôi cấy trong môi trường lỏng hay lỏng lắc có hiện tượng đa chồi và các chồi được nuôi cấy trong điều kiện này khỏe mạnh có thân to và xanh chắc hơn so với chồi nuôi cấy trong môi trường rắn hoặc trong môi trường hai lớp rắn và lỏng. Lực khuếch tán của các anion và cation trong môi trường có agar thấp nên mẫu cấy chỉ có thể sử dụng một phần chất dinh dưỡng đưa vào môi trường, do đó ở nghiệm thức chỉ sử dụng duy nhất môi trường rắn có sự tăng sinh khối thấp hơn so với các nghiệm thức có bổ sung môi trường lỏng. Trong nghiên cứu của Đỗ Mạnh Cường và cộng sự , 2015 trên cây Lan gấm cũng đã cho thấy chồi được nuôi cấy trên môi trường lỏng có giá đỡ là cầu bông gòn đã giúp cho cây phát triển tốt hơn và khối lượng tươi đạt cao hơn so với các nghiệm thức còn lại [7]. Ở môi trường ngoài tự nhiên, thực vật có hai cơ chế vận chuyển nước và chất khoáng đó là áp suất rễ và thế nước (giữa một điểm là ở trong đất và một điểm ở trong khí quyển). Trong điều kiện tự nhiên bình thường, áp suất rễ đủ để cung cấp nước và chất dinh dưỡng cho cây trong một khoảng cách dài, tuy nhiên trong điều kiện nuôi cấy mô, khi các chồi không có rễ hay bộ rễ chưa hoàn chỉnh nên chất dinh dưỡng được hút lên chủ yếu theo cơ chế thẩm thấu nên khi bổ sung môi trường lỏng vào môi trường nuôi cấy ban đầu đã giúp cho chồi hấp thụ dinh dưỡng dễ dàng hơn dẫn đến quá trình tăng sinh khối cao hơn.

Kết quả thí nghiệm này cho thấy, trạng thái môi trường lỏng đã giúp gia tăng hiệu sinh khối cây A. formosanus Hayata. Việc bổ sung môi trường lỏng vào bình nuôi cấy có môi trường rắn hoặc sử dụng hoàn toàn môi trường lỏng để nuôi cấy đều cho kết quả tăng trưởng tốt hơn trên môi trường sử dụng agar tạo môi trường thạch. Đặc biệt nghiệm thức sử dụng trạng thái môi trường lỏng lắc với tốc độ lắc 100 vòng/phút là hiệu quả cao nhất cho sự gia tăng sinh khối cây A. formosanus Hayata.



c:\users\hp\downloads\bai bao copy.jpg

Hình 1 Chồi cây Lan gấm nuôi cấy trong các môi trường khoáng. a1, a2: Chồi nuôi cấy trong môi trường MS rắn; b1, b2: Chồi nuôi cấy trong môi trường MS lỏng; c1,c2: Chồi nuôi cấy trong môi trường Albert’s; d1, d2: Chồi nuôi cấy trong môi trường Dr Alan Cooper; e1,e2: Chồi nuôi cấy trong môi trường Knudson C. f: môi trường nuôi cấy hai lớp; g: môi trường nuôi cấy lỏng lắc; h: môi trường nuôi cấy rắn; h: môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh.

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng môi trường khoáng Albert’s không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật thích hợp cho sự nhân nhanh sinh khối cây A. formosanus Hayata. Môi trường lỏng thích hợp cho gia tăng sinh khối đặc biệt là trạng thái nuôi cấy lỏng lắc với tốc độ 100 vòng/phút cho sinh khối Lan gấm tăng cao nhất. Bên canh đó, sinh khối Lan gấm thu được đảm bảo an toàn về dư lượng NO3-, kim lọai nặng Cu và Zn đối với sức khỏe người tiêu dùng.



Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Đề tài Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ tế bào thực vật (Viện Sinh học Nhiệt đới) đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

  1. Aitken-Christie J. and Davies H.E. 1995. Development of asemi-automated
    micropropagation system. Acta Horticulture. 230: 81˗87.

  2. BYT 2007: Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm được quy định theo Nghị định số 49/2003/NĐ-CP ngày 15 tháng 5 năm 2003 của Bộ Y Tế.

  3. Chaillou S. and Chaussat R. 1986. Changes in mineral concentration of potato organ fragments. Phytomorph. 36: 263˗270.

  4. Chiu N.Y. and K.H. Chang. 1995. Anoectochilus formosanus Hayata. In: The
    Illustrated Medicinal Plants of Taiwan. SMC Publishing Inc., Taipei, Taiwan. 4: 282-283.

  5. Cooper A.J. 1973. Rapid crop turn-round is possible with experimental nutrient film technique. Grower. 79: 1048˗1052.

  6. Debergh P.C. 1983. Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium. Physiologiae Plant. 59: 270-276.

  7. Đỗ Mạnh Cường, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Thanh Sang, Nguyễn Hồng Hoàng, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Xuân Tuấn, Trần Hiếu, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Thị Kim Loan, Dương Tấn Nhựt. 2015. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan gấm (Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 13(3): 337˗344.

  8. George E.F. 1993. Plant propagation by tissue culture. Part 1- The technology. Edington: Exegetics limited. 337˗356.

  9. Guru S.K., Chandra R., Khetrapal S., Raj A. and Palisetty R. 1999. Protein pattern in differentiating explants of chickpea (Cicer arietinum L.). Indian Journal Plant Physiol. 4: 147˗151.

  10. Hayter A.J. 1986. The maximum familywise error rate of Fisher’s least signifi-cant difference test. Journal of the American Statistical Association. 81: 1001˗1004.

  11. Hu S.Y. 1971. The Orchidaceae of China. Quarterly Journal of the Taiwan Museum
    24: 67˗103.

  12. Kan W.S. 1986. Anoectochilus formosanus Hayata. In: Pharmaceutical Botany.
    National Research Institute of Chinese Medicine. Taipei, Taiwan.

  13. Kjeldahl J. 1883.  New method for the determination of nitrogen in organic substances. Zeitschrift für analytische Chemie. 22(1): 366˗383.

  14. Knudson L. 1946. A new nutrient solution for germination of orchid seeds. Am. Orchid Soc. Bull. 15: 214-217.

  15. Lai N. and Singh H.N. 1994. Rapid clonal multiplication of sugarcane through tissue culture. Plant Tissue Culture. 4: 1˗7.

  16. Lin C.S., Kalpana K., Chang W.C. and Lin N.S. 2007. Improving multiple shoot proliferation in bamboo mosaic virus-free Bambusa oldhamii Munro propagation by liquid culture. HortScience. 42(5): 1243˗1246.

  17. Martin K.P., Geevarghese J., Joseph D. and Madassery J. 2005. In vitro propagation of Dendrobium hybrids using flower stalk node explants. Indian Journal Experimental. Biology. 43: 280˗285.

  18. Mbiyu M., Jane M., Jackson K., Christine M., Patrick P., Joseph N., John O. and Susan O. 2012. Comparing liquid and solid media on the growth of plantlets from three Kenyan Potato cultivars. American Journal of Experimental Agriculture. 2(1): 81˗89.

  19. Murashige T. and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15: 473˗497.

  20. Ormerod P. 2005. Notulae Goodyerinae (II). Taiwania. 50(1): 1˗10.

  21. Quy định về hàm lượng nitrat trong rau sạch. http://agro.gov.vn/.

  22. Scholten H.J. and Pierik R.L.M. 1998. Agar as a gelling agent: chemical and physical
    analysis. Plant Cell. 17: 230˗235.

  23. Võ Thị Bạch Mai. 2003. Thủy canh cây trồng. Nhà xuất bản Đại học quốc gia, Tp. HCM.


EFFECT OF FREE PLANT GROWTH REGULATOR MEDIUM TO INCREASE BIOMASS AND IDENTIFY ACCUMULATION OF NO3-, HEAVY METAL IN BIOMASS OF ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA

Do Dang Giap*, Do Duc Thang, Tran Trong Tuan, Nguyen Thi Huyen Trang, Do Thi Tuyen

Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology

*Email: dodanggiap@gmail.com

In this report, the role of mineral media such as Murashige and Skoog, Knudson C, Dr Alan Cooper and Albert’s without plant growth regulators to increase Anoectochilus formosanus Hayata biomass was studied. The results indicated that Albert’s medium was the most suitable to rapid multiplicate biomass of A. formosanus Hayata, seedling growth revealed completely and healthily with 10.13 cm of plant height, 2.43 g/plant of fresh weight and dry weight was 0.3 g/plant. Besides, shoots were examined on different condition media such as solid, solid combined with liquid, liquid and shake-liquid for the greatest multiplication rate of biomass. The highest one was found when Anoectochilus formosanus Hayata was cultured on the shake-liquid medium. The analysis results of the accumulation of NO3- and heavy metal such as Zn and Cu in biomass were under standard permission of WHO and Ministry of Health Portal. Thus, biomass derived from in vitro culture is safe for human health.



Key words: Anoectochilus formosanus Hayata, Albert’s, heavy metal, mineral medium, shake-liquid culture
Каталог: app -> webroot -> files -> hoithao
hoithao -> Jatropha curcas L. TẠi thừa thiên huế
hoithao -> Nghiên cứu một số chỉ số nhân trắc cơ bản
hoithao -> Nghiên cứu một số chỉ SỐ thể LỰc của học sinh từ 8-15 tuổI Ở TỈnh bình dưƠng nguyễn Thị Thu Hiền
hoithao -> Thực trạng kiến thức, thái độ, hành VI về sức khỏe sinh sản của sinh viên trường Cao đẳng Sư phạm Thái Bình
hoithao -> Metfformin – Tác nhân kích thích sự di chuyển và phản ứng acrosome của tinh trùng gà
hoithao -> Piv-chương 1 Lịch Triều Lược Kỷ (1528 1802)
hoithao -> Lê Thị Hương1,*, Trần Thị Thúy Nga
hoithao -> Bùi Thu Hà1, La Thị Mai Loan
hoithao -> Nguyễn Thị Hồng Hạnh1, Bùi Thị Nhung*2, Trần Quang Bình3, Lê Thị Hợp2

tải về 0.54 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©tieuluan.info 2022
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương