Metfformin – Tác nhân kích thích sự di chuyển và phản ứng acrosome của tinh trùng gà



tải về 68.42 Kb.
Chuyển đổi dữ liệu20.11.2017
Kích68.42 Kb.
#2360


Metfformin – Tác nhân kích thích sự di chuyển

và phản ứng acrosome của tinh trùng gà

Nguyễn Thị Mộng Điệp1*, Đỗ Thu Hà2



1 Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Quy Nhơn.

2 Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.

* Tác giả liên hệ: TS. Nguyễn Thị Mộng Điệp - Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Quy Nhơn, 170 An Dương Vương, Quy Nhơn, Bình Định.

Tel: 09 64 74 50 83 ; Email: diepdhqn@ymail.com

Tóm tắt:

Tinh trùng là tế bào mầm với chức năng chính là sự vận động và thực hiện phản ứng acrosome để thụ tinh với trứng. Hiện nay, nhiều hóa chất được thêm vào tinh dịch nhằm nâng cao chất lượng của tinh trùng. Metfformin (Metf), thường được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường loại II, Metf sở hữu những thuộc tính ảnh hưởng đến sự kiểm soát các quá trình trao đổi chất trong tế bào nhưng vẫn chưa được đánh giá nhiều trong tinh trùng. Mục đích của thí nghiệm này là; (a) xác định hiệu quả của Metf đến các thông số di chuyển và khả năng thực hiện thành công phản ứng acrosome của tinh trùng gà tươi; (b) đánh giá các hiệu ứng của Metf đến chức năng của tinh trùng bảo quản lạnh. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng sự hiện diện của Metf trong tinh trùng tươi gây ra tác động tích cực đến chất lượng tinh trùng, đồng thời cải thiện sự suy giảm tốc độ di chuyển của tinh trùng do bảo quản đông lạnh.



Từ khóa: Metfformin, tinh trùng, di chuyển tinh trùng, phản ứng acrosome.

Đặt vấn đề

Metfformin (1,1-diMetfhylbiguanide hydrochloride) là thuốc uống đầu tiên dùng điều trị bệnh tiểu đường type 2, làm giảm lượng đường trong máu và cải thiện các thông số lipid máu mà không ảnh hưởng đến sự tiết insulin [21, 24]. Tác dụng hạ đường huyết của Metf được giải thích bằng cách tăng sự hấp thu glucose của cơ bắp [10] và giảm sản xuất glucose ở gan [9]. Hợp chất dược lý này cũng tham gia vào các quá trình oxy hóa của các axit béo trong gan, làm giảm tổng hợp của axit béo [26]. Metf còn là chất kích hoạt tiềm năng của protein kinase, AMP-activated protein kinase (AMPK) [27], một protein serine / threonine, trung tâm của quá trình trao đổi năng lượng, đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa glucose và chất béo trong tế bào[20].

Đông lạnh tinh trùng là kỹ thuật tối ưu nhất cho việc lưu trữ lâu dài tinh trùng, để bảo quản vật liệu di truyền quý báu có nguy cơ tuyệt chủng và quản lý vô sinh ở người. Tuy nhiên bất chấp những tiến bộ về khoa học kỹ thuật trong những năm qua, ở hầu hết các loài, chất lượng và chức năng của tinh trùng sau rã đông là giảm rất nhiều so với tinh trùng tươi [5, 13]. Bảo quản lạnh gây tổn thương vĩnh viễn tới tinh trùng như: mất khả năng vận động, thiệt hại AND, acrosome, ty thể, màng tế bào ... [5, 13-14, 23]. Vì vậy, trong các giao thức bảo quản lạnh, thành phần và tính chất của các chất bảo vệ lạnh có tầm quan trọng rất lớn đối với sự sống còn của tinh trùng sau bảo quản lạnh [1, 6]. Trong số các hóa chất có khả năng bảo vệ tế bào thì Metf vẫn chưa được thử nghiệm trong qúa trình bảo quản lạnh tinh trùng. Ngoài những tác dụng dược lý đã nêu trên thì Metf còn có khả năng giảm các loài ôxy phản ứng (Reactive oxygen species, ROS) [7, 19] và để kích hoạt các yếu tố phiên mã Nrf2, dẫn đến tăng biểu hiện của gen chống oxy hóa [17]. Ở cấp độ tế bào chất, Metf có khả năng làm giảm hoạt động của ty lạp thể ở pha thứ nhất (Complex 1), và do đó giảm sự sản sinh ROS.



Mặc dù Metf đã được sử dụng trong 50 năm qua nhưng cơ chế tác dụng của Metf chỉ mới thực sự bắt đầu được hiểu kỹ hơn trong thập niên qua. Xuất phát từ những đặc tính quan trọng của Metf, chúng tôi đã tiến hành đánh giá sự ảnh hưởng của Metf đến chất lượng tinh trùng trước và sau bảo quản lạnh bằng cách bổ sung trực tiếp Metf vào trong tinh dịch.

Đối tượng/Nguyên liệu và Phương pháp nghiên cứu

Hóa chất và thuốc thử: Tất cả các hóa chất được mua từ Sigma-Aldrich trừ khi có ghi chú khác. Metf được mua từ Calbiochem. Dung dịch Metf đã được pha loãng trong nước khử ion. PI / Sybr 14 và PNA/FITC (chất nhuộm huỳnh quang) được mua từ Molecular Probes.

Đối tượng nghiên cứu: Tinh trùng thu được từ 15 con gà trống Gallus domesticus với độ tuổi từ 28-55 tuần tuổi. Mỗi con được nuôi nhốt trong chuồng nuôi nhốt cá thể theo một chu kỳ sáng 14L / 10D và cho ăn một chế độ ăn uống tiêu chuẩn là 12,5 MJ / ngày.

Thu tinh dịch: Tinh dịch được thường xuyên thu thập hai lần một tuần bằng phương pháp massage bụng [4]. Nồng độ tinh trùng đã được xác định với một quang phổ kế (IMV, L'Aigle, Pháp) ở bước sóng 530 nm. Tinh dịch được trộn nhẹ nhàng sau khi thu thập từ mỗi con gà và chia thành hai nhóm cho việc điều trị tươi và đông lạnh. Tinh trùng tươi được pha loãng trong dung dịch đệm đặc trưng ở gia cầm Beltsville Poultry Semen Extender (BPSE) [22] để có được một nồng độ tinh trùng cuối cùng là 1 x 109 tế bào / ml trước khi sử dụng.

Kỹ thuật đông lạnh tinh trùng: Tinh dịch được pha loãng theo tỷ lệ 1:1 trong dung dịch đệm Lake PE [12] trong sự xuất hiện hoặc vắng mặt Metf (1mM) và chất bảo vệ lạnh là Glycerol 11%, sau đó được cân bằng ở 4°C. Sau khi cân bằng, tinh dịch được chuyển vào ống hút nhựa 0,5 ml đã làm lạnh trước đó (IMV, L'Aigle, Pháp) và cuối cùng đem đông lạnh theo chương trình Minidigitcool 1400 (IMV, L'Aigle, Pháp). Sau đó các ống nhựa chứa tinh trùng đã đông lạnh sẽ được bảo quản trong bình chứa nitơ lỏng (-196°C).

Xác định tỷ lệ sống của tinh trùng: PI / Sybr-14 đã được sử dụng để đánh giá tính toàn vẹn của màng tinh trùng trước khi đóng băng và sau khi rã đông. PI (Propidium iodide) và Sybr-14 là những phân tử huỳnh quang thường được sử dụng để đánh dấu các ADN trong nhân tế bào. PI thì dùng đánh dấu những tế bào đã bị tổn thương về màng (chết) và tinh trùng thường có màu đỏ khi bắt PI. Sybr-14 cho thấy sự phát huỳnh quang màu xanh lá cây ở những tế bào sống. Tổng cộng có 300 tinh trùng được tính / lam kính (hai lam / mẫu = 1 lần lặp lại) dưới kính hiển vi huỳnh quang (Zeiss Axioplan 2; Zeiss Gruppe, Jena, Đức) và tổng cộng 6 lần lặp lại / xử lý.

Phân tích khả năng vận động của tinh trùng bằng máy CASA [3]: Trong thí nghiệm này, các thông số đo được là tỷ lệ phần trăm tinh trùng có hoạt lực (%), vận tốc đường cong (VCL, trong µm / s), vận tốc đường dẫn (VAP, trong µm / s), vận tốc đường thẳng ( VSL, µm / s) và tinh trùng di chuyển nhanh (tỷ lệ phần trăm tinh trùng có hoạt lực với VAP > 50μm / s).

Đánh giá phản ứng acrosome của tinh trùng: Phản ứng acrosome đã được phát hiện bởi PNA/FITC [8]. Các tinh trùng đã hoàn thành phản ứng acrosome (phát huỳnh quang màu xanh lá cây ở vùng acrosome) được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Zeiss Axioplan 2; Zeiss Gruppe, Jena, Đức). Tổng cộng có 200 tinh trùng / lam kính (2 lam kính / mẫu = 1 lần lặp lại) và tổng cộng 6 lần lặp lại / xử lý.

Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu được trình bày dưới dạng trung bình (mean) ± sai số chuẩn trung bình (SEM). Phân tích thống kê được thực hiện với phần mềm GraphPad InStat (GraphPad Software, San Diego, CA). Ý nghĩa của sự khác biệt giữa các phương pháp điều trị đã được xác định bằng phép kiểm Dunnett’s post test (One-way ANOVA). Mức ý nghĩa đã được thiết lập ở mức P <0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

  1. Metf làm tăng tốc độ di chuyển và khích thích phản ứng acrosome tinh trùng.

Để đánh giá tác động của Metf (1 mM) đến khả năng vận động, tinh trùng gà được ủ trong môi trường dung dịch đệm BPSE với sự có mặt hay vắng mặt của Metf tại 35°C trong khoảng thời gian 60 phút. Theo quan sát trong hình 1, điều trị ngắn 60 phút với Metf dẫn đến một ý nghĩa tăng các thông số di chuyển của tinh trùng (Bảng 1).

Kết quả trong hình 1 của chúng tôi cũng cho thấy rằng Metf có khả năng kích thích quá trình thực hiện thành công phản ứng acrosome của tinh trùng. Trong các loài động vật thụ tinh trong, tinh trùng phải trải qua các phản ứng acrosome để thâm nhập và thụ tinh với trứng [16]. Acrosome có nguồn gốc từ Golgi và nằm ở vùng đầu của tinh trùng. Phản ứng acrosome liên quan đến việc hợp nhất giữa màng tinh trùng và màng acrosome và kết quả là phát hành các nội dung bên trong của acrosome [18]. Ở động vật có vú, để bắt đầu phản ứng acrosome, tinh trùng phải trải qua giai đoạn capacitation trong đường sinh dục nữ [25]. Ngược lại với động vật có vú, các phản ứng acrosome của tinh trùng gà có thể được gây ra rất nhanh chóng trong ống nghiệm sau khi ủ tinh trùng trong sự hiện diện của màng trứng và Ca2+ ngoại bào [8], tương ứng với một thời gian dài của tinh trùng trong ống dẫn trứng gà trước khi bắt đầu của phản ứng [2].

Bảng 1: Thông số di chuyển của tinh trùng sau khi bổ sung Metf so với đối chứng. Thí nghiệm được thực hiện 6 lần; giá trị (%) là trung bình (mean) ± SEM. Chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mẫu đối chứng và mẫu có bổ sung Metf (* P <0,05).


Thông số di chuyển

Đối chứng

Metf (1mM)

Di chuyển (%)

40.0 ± 6.6a

61.3 ± 4.3b

Di chuyển nhanh (%)

36.0 ± 4.2a

57.2 ± 4.3b

VAP (µm\s)

75.2 ± 3.5a

88.4 ± 6.7b

VSL (µm\s)

64.4 ± 3.8a

77.2 ± 7.7b

VCL (µm\s)

121.0 ± 2.7a

132.3 ± 4.2ab



Hình 1: Tỷ lệ phần trăm tinh trùng thực hiện thành công phản ứng acrosome sau khi bổ sung Metf so với đối chứng. Thí nghiệm được thực hiện 6 lần; giá trị (%) là trung bình (mean) ± SEM. Chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mẫu đối chứng và mẫu có bổ sung Metf (* P <0,05).

Như vây, kết quả của chúng tôi cho thấy Metf đã tham gia trong quá trình điều tiết tốc độ di chuyển cũng như kích thích phản ứng acrosome thành công của tinh trùng. Như đã trình bày ở trên, Metf còn là một chất kích thích của protein AMPK. Trong các mô động vật có vú, protein AMPK kiểm soát sự trao đổi chất bằng cách kích hoạt đường sản sinh ra ATP và đồng thời ức chế những đường tiêu thụ ATP [20]. Hiện nay, đã có một vài nghiên cứu chứng minh được sự tồn tại của AMPK trong tế bào tinh trùng ở lợn, chuột, gà [1, 11, 15]. Do vậy, với những kết quả nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng protein AMPK đã được kích hoạt bởi Metf và sau đó nó tham gia kích hoạt các quá trình sản sinh năng lượng nhằm cung cấp ATP để thực hiện các chức năng của tinh trùng.



  1. Metf cải thiện chất lượng tinh trùng sau đông lạnh và rã đông.

Trên cơ sở những kết quả của phần một, chúng tôi đã tiến hành bổ sung Metf trong quá trình bảo quản lạnh tinh trùng gà. Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng, tốc độ di chuyển của tinh trùng khi có sự xuất hiện của Metf tăng 23% và tốc độ di chuyển nhanh của tinh trùng tăng 46% so với mẫu đối chứng không bổ xung Metf.



Hình 2: Ảnh hưởng của Metf đến tốc độ di chuyển và tốc độ di chuyển nhanh sau khi rã đông tinh trùng. Thí nghiệm được thực hiện 6 lần; giá trị (%) là trung bình (mean) ± SEM. Dấu hoa thị chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mẫu đối chứng và mẫu có bổ sung Metf (* P <0,05).

Từ những kết quả này, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng Metf có thể cải thiện khả năng vận động của tinh trùng khi bảo quản lạnh. Bertoldo et al. cũng đã cho ra những quan sát tương tự, họ nói rằng Metf có thể cải thiện khả năng sống và di chuyển của tinh trùng chuột ở giai đoạn epididymis sau khi rã đông [1].



Kết luận

Kết quả của chúng tôi đã cho thấy rằng, sự hiện diện của các chất kích hoạt AMPK, Metf trong tinh dịch gà không chỉ cải thiện chất lượng của tinh trùng gà tươi (tốc độ di chuyển và khả năng thực hiện thành công phản ứng acrosome), mà còn có khả năng phục hồi tốc độ di chuyển của tinh trùng đông lạnh. Những đánh giá này cho thấy một cái nhìn mới về đặc tính của Metf trong tế bào sinh sản và sẽ rất hữu ích để phát triển và cải thiện kỹ thuật đông lạnh tinh dịch gà trong tương lai gần.



References

  1. Bertoldo MJ, Guibert E, Tartarin P, Guillory V, Froment P, 2014. Effect of Metfformin on the fertilizing ability of mouse spermatozoa. Cryobiology, 68, 262-268.

  2. Blesbois E, Brillard JP, 2007. Specific features of in vivo and in vitro sperm storage in birds, Animal, 1, 1472–1481.

  3. Blesbois E, Grasseau I, Seigneurin F, Mignon-Grasteau S, Saint Jalme M, et al. 2008. Predictors of success of semen cryopreservation in chickens, Theriogenology, 69, 252-261.

  4. Burrows WH, Quinn JP, 1937. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science, 16, 19-24.

  5. Curry MR, 2000. Cryopreservation of semen from domestic livestock, Rev. Reprod, 5, 46–52.

  6. Curry MR, Millar JD, Watson PF, 1994. Calculated optimal cooling rates for ram and human sperm cryopreservation fail to conform with empirical observations. Biology of reproduction, 51, 1014-1021.

  7. Esteghamati A, Eskandari D, Mirmiranpour H, Noshad S, Mousavizadeh M, Hedayati M, Nakhjavani M, 2013. Effects of Metfformin on markers of oxidative stress and antioxidant reserve in patients with newly diagnosed type 2 diabetes: a randomized clinical trial. Clinical nutrition, 32, 179-185.

  8. Horrocks AJ, Stewart S, Jackson L, Wishart GJ (2000) Induction of acrosomal exocytosis in chicken spermatozoa by inner perivitelline-derived N-linked glycans. Biochem Biophys Res Commun 278: 84-89.

  9. Hundal RS, Krssak M, Dufour S, Laurent D, Lebon V, Chandramouli V, Inzucchi SE, Schumann WC, Petersen KF, Landau BR, Shulman GI, 2000. Mechanism by which Metfformin reduces glucose production in type 2 diabetes. Diabetes, 49, 2063-2069.

  10. Hundal HS, Ramlal T, Reyes R, Leiter LA, Klip A, 1992. Cellular mechanism of Metfformin action involves glucose transporter translocation from an intracellular pool to the plasma membrane in L6 muscle cells. Endocrinology, 131, 1165-1173.

  11. Hurtado de Llera A, Martin-Hidalgo D, Gil MC, Garcia-Marin LJ, Bragado MJ, 2012. AMP-activated kinase AMPK is expressed in boar spermatozoa and regulates motility. PLoS One, 7, e38840.

  12. Lake PE, 1968. Observations on freezing fowl spermatozoa in liquid nitrogen, VI Cong. Int Reprod Anim Insem Artif, 2, 1633-1635.

  13. Morris GJ, Acton E, Murray BJ, Fonseca F, 2012. Freezing injury: the special case of the sperm cell, Cryobiology, 64, 71–80.

  14. Neild DM, Brouwers JFHM, Colenbrander B, Agüero A, Gadella BM, 2005. Lipid peroxide formation in relation to membrane stability of fresh and frozen thawed stallion spermatozoa, Mol. Reprod. Dev, 72, 230–238.

  15. Nguyen TM, Alves S, Grasseau I, Metfayer-Coustard S, Praud C, Froment P, Blesbois E, 2014. Central role of 5'-AMP-activated protein kinase in chicken sperm functions. Biology of reproduction, 91, 121.

  16. Olsen MW, 1942. Maturation, fertilization and early cleavage in the hen's egg. Journal of Morphology, 70, 513-533.

  17. Onken B, Driscoll M, 2010. Metfformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PloS one, 5, e8758.

  18. Oura C, Toshimori K, 1990. Ultrastructural studies on the fertilization of mammalian gaMetfes. International Review of Cytology, 122, 105-151.

  19. Ouslimani N, Peynet J, Bonnefont-Rousselot D, Therond P, Legrand A, Beaudeux JL, 2005. Metfformin decreases intracellular production of reactive oxygen species in aortic endothelial cells. Metfabolism: clinical and experimental, 54, 829-834.

  20. Sanz P, 2008. AMP-activated protein kinase: Structure and regulation. Curr. Protein Pept. Sci, 9, 478–492.

  21. Scheen AJ, 2003. Current management of coexisting obesity and type 2 diabetes. Drugs, 63, 1165-1184.

  22. Sexton TJ, 1977. A new poultry semen extender. 1. Effects of extension on the fertility of chicken semen, Poult Sci, 56, 1443-1446.

  23. Watson PF, 2000. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen, Anim. Reprod. Sci, 60–61, 481–482.

  24. Wu MS, Johnston P, Sheu WH, Hollenbeck CB, Jeng CY, Goldfine ID, Chen YD, Reaven GM, 1990. Effect of Metfformin on carbohydrate and lipoprotein Metfabolism in NIDDM patients. Diabetes Care, 13, 1-8.

  25. Yanagimachi R, 1994. Mammalian fertilization. In The Physiology of Reproduction, edn 2, pp 189-317. Eds E Knobil and JD Neill. New York: Raven Press.

  26. Zang M, Zuccollo A, Hou X, Nagata D, Walsh K, Herscovitz H, Brecher P, Ruderman NB,Cohen RA, 2004. AMP-activated protein kinase is required for the lipid-lowering effect of Metfformin in insulin-resistant human HepG2 cells. J. Biol. Chem, 279, 47898-47905.

  27. Zhou G, Myers R, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, Wu M, Ventre J, Doebber T, Fujii N, 2008. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of Metfformin action. The Journal of clinical investigation, 108, 1167-1174.

Abstract

Sperm are germinal cells whose main functions, motility and acrosome reaction, promote its essential function: the oocyte fertilization. Currently, many chemicals are added to the media to enhance sperm quality. Metformin, which is commonly used for the treatment of type II diabetes, possesses properties impacting cell metabolism control that have not been assessed yet in sperm. The aims of this experiment were to: (a) determine the effects of Met on fresh chicken sperm motility and ability to perform acrosome reaction; (b) evaluate its effects on the functions of cryopreserved sperm. These experiments have shown that the presence of Met in fresh semen has a positive impact on the quality of sperm by reducing the decline in sperm motility and ability to perform acrosome reaction.



Keywords : Chicken sperm, sperm motility, Lipid oxidation, reactive oxygen species, Metfformin.


Каталог: app -> webroot -> files -> hoithao
hoithao -> Jatropha curcas L. TẠi thừa thiên huế
hoithao -> Nghiên cứu một số chỉ số nhân trắc cơ bản
hoithao -> Nghiên cứu một số chỉ SỐ thể LỰc của học sinh từ 8-15 tuổI Ở TỈnh bình dưƠng nguyễn Thị Thu Hiền
hoithao -> Ảnh hưỞng của môi trưỜng nuôi cấy không sử DỤng chấT ĐIỀu hòa sinh trưỜng lên khả NĂng tăng sinh khối và XÁC ĐỊnh dư LƯỢng nitrat, kim loại nặng có trong mẫu cây lan gấM
hoithao -> Thực trạng kiến thức, thái độ, hành VI về sức khỏe sinh sản của sinh viên trường Cao đẳng Sư phạm Thái Bình
hoithao -> Piv-chương 1 Lịch Triều Lược Kỷ (1528 1802)
hoithao -> Lê Thị Hương1,*, Trần Thị Thúy Nga
hoithao -> Bùi Thu Hà1, La Thị Mai Loan
hoithao -> Nguyễn Thị Hồng Hạnh1, Bùi Thị Nhung*2, Trần Quang Bình3, Lê Thị Hợp2

tải về 68.42 Kb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©tieuluan.info 2022
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương