Cộng hoà XÃ HỘi chủ nghĩa việt nam



tải về 3.21 Mb.
trang64/78
Chuyển đổi dữ liệu14.11.2017
Kích3.21 Mb.
#1729
1   ...   60   61   62   63   64   65   66   67   ...   78

GIÁM ĐỊNH ADN TI THỂ



I. Đối tượng và phạm vi áp dụng

Áp dụng cho tổ chức, cá nhân thực hiện giám định pháp y trên toàn quốc.



II. Hồ sơ giám định

Nhận hồ sơ từ người trưng cầu, yêu cầu giám định trực tiếp hoặc gián tiếp qua đường bưu điện, gồm:

- Quyết định trưng cầu, yêu cầu giám định hợp pháp.

- Các tài liệu khác có liên quan.



III. Nghiên cứu hồ sơ

- Nghiên cứu hồ sơ, đối chiếu với nội dung trung cầu, yêu cầu giám định.

- Tính pháp lý của hồ sơ giám định, những tài liệu cần bổ sung.

IV. Quyết định hay từ chối giám định

- Thực hiện giám định: nếu thấy đủ điều kiện cần thiết để thực hiện giám định theo nội dung trưng cầu, yêu cầu giám định hoặc yêu cầu giám định của cá nhân, tổ chức.

- Từ chối giám định trong những trường hợp sau đây:

+ Quyết định trưng cầu, yêu cầu giám định không đủ tính pháp lý.

+ Yêu cầu của cơ quan giám định không được đáp ứng.

+ Nội dung trưng cầu, yêu cầu giám định vượt quá giới hạn về chuyên môn, cán bộ, phương tiện, thời gian.

- Từ chối giám định bằng văn bản và nêu rõ lý do.



V. Chuẩn bị giám định

1. Cán bộ chuyên môn

- Giám định viên: 02 người

- Người giúp việc: 02 người

2. Phương tiện

- Dụng cụ thu mẫu: Bộ kít thu mẫu, thẻ lấy mẫu, lọ đựng mẫu, cồn sát khuẩn, găng tay, khẩu trang, cưa xương, vv...

- Trang thiết bị: Hệ thống máy giải trình tự gen, máy luân nhiệt (PCR), máy Realtime PCR, máy chụp ảnh gel, máy điện di, máy ly tâm eppendorf 10.000, máy ly tâm lạnh, máy lắc có điều chỉnh nhiệt độ, máy khuấy từ, máy trộn vortex, máy đo pH, cân điện, tủ lạnh 40C, -200C và -800C, tủ sấy, tủ an toàn sinh học, máy cất nước 1 lần, máy cất nước 2 lần, máy sấy, các loại pipet tự động, Water bath 56oC, block nhiệt 65oC, giá từ tính (Cat.# Z5410 hoặc Cat. #Z5332 hoặc Cat.# Z5342), vv...

- Hóa chất: Các bộ kít dùng cho tách chiết ADN, kít khuếch đại trình tự gen trên các vùng siêu biến HVI, HVII trên hệ gen ti thể, kít tinh sạch, giải trình tự gen, điện di, các loại hóa chất cần thiết cho từng công đoạn phân tích, vv...

+ Ethanol 95–100%

+ Isopropyl Alcohol

+ Proteinase K

+ Incubation Buffer

+ Bone Incubation Buffer

+ DNA IQ™ System (Cat.# DC6700 or DC6701)

+ DNA IQ™ Lysis Buffer (Cat.# A8261)

+ DTT


- Vật tư tiêu hao: Các loại ống nghiệm, đầu côn, găng tay, khẩu trang, quần áo bảo hộ, kính bảo hộ, cồn, giấy, Nước cất khử ion, dao mổ, ống li tâm 15ml, ống li tâm 1,5ml, vv...

- Phương tiện khác: máy ảnh, máy vi tính, máy in, vv...

- Pha hóa chất (nếu tách chiết ADN ti thể từ mẫu xương bằng DNA IQ™ của hãng Promega):

1. Pha Stock Proteinase K Solution.

Thêm 5,5ml Incubation Buffer vào lọ 100mg Proteinase K (nồng độ cuối cùng là 18mg/ml).

2. Pha Proteinase K Digestion Solution.

- Bone Incubation Buffer 944µl

- Stock Proteinase K Solution 56µl

- Tổng thể tích 1000µl

(Chuẩn bị khoảng 3ml/mẫu)

3. Pha DTT 1M.

- Cân 0,154g DTT thêm vào 1ml.

4. Pha Lysis Buffer.

- Thêm 1µl DTT 1M vào 100µl of Lysis Buffer.

5. Pha 1X DNA IQ™ Wash Buffer.

- Thêm vào 15ml Ethanol 95–100% và 15ml Isopropyl alcohol. (Dùng cho

DNA IQ™ System (Cat.# DC6701: 100 samples))

VI. Các bước giám định

1. Thu mẫu

a) Mẫu do cơ quan trưng cầu mang đến

- Đeo găng tay, khẩu trang.

- Ghi nhận tình trạng bảo quản mẫu.

- Kiểm tra niêm phong.

- Chụp ảnh mẫu còn nguyên niêm phong.

- Mở niêm phong.

- Kiểm tra mẫu: loại mẫu, số lượng mẫu, tình trạng mẫu.

- Chụp ảnh mẫu.

- Lập biên bản giao nhận mẫu theo qui định.

b) Mẫu thu trực tiếp tại hiện trường



Bước 1. Chuẩn bị: Đeo găng tay, khẩu trang, tuýp đựng mẫu, vv …

Bước 2. Ghi ký hiệu, vị trí thu mẫu bên ngoài tuýp đựng mẫu.

Bước 3. Chụp ảnh mẫu.

Bước 4. Thu mẫu theo các bước cho phù hợp từng loại mẫu.

Bước 5. Cho mẫu vào tuýp, túi, lọ đựng và bảo quản theo quy định.

Bước 6. Lập biên bản thu mẫu theo qui định.

c) Mẫu gửi giám định qua đường bưu điện



Phải có ít nhất hai người nhận mẫu lập biên bản kiểm tra mẫu, ghi rõ thời gian nhận mẫu, số lượng tình trạng mẫu, tình trạng niêm phong, mở niêm phong và chụp ảnh mẫu.

2. Tách chiết ADN

a) Tách chiết ADN ti thể: Mẫu máu tươi, máu khô, mẫu móng tay, móng chân, mẫu tóc, tế bào niêm mạc miệng, mô, vv...

Đối với từng loại mẫu khác nhau sẽ được xử lý, tách chiết bằng một trong các phương pháp tương ứng sau:

- Tách chiết ADN bằng phương pháp vô cơ (sử dụng Chelex).

- Tách chiết ADN bằng phương pháp hữu cơ (có sử dụng phenol/chloroform).

- Sử dụng các kít tách chiết thương mại:

+ Tách chiết ADN bằng Qiamp® DNA micro kits,

+ Tách chiết ADN bằng Qiamp® DNA mini kits.

+ Tách chiết ADN bằng Qiamp® DNA blood mini kits.

+ Tách chiết ADN bằng DNA IQTM System của hãng Promega.

- Tách chiết ADN bằng các phương pháp khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất.

b) Tách chiết ADN ti thể từ mẫu xương bằng DNA IQ™ của hãng Promega.

Bước 1. Nghiền nhỏ khoảng 2g xương với dụng cụ sạch tránh nhiễm.

Bước 2. Chuyển xương vừa nghiền nhỏ vào ống li tâm 15ml, bổ sung thêm 3ml Proteinase K Digestion Solution. Ủ ở nhiệt độ 56°C ít nhất là 1 giờ.

(Chú ý: thời gian và lượng Proteinase K Digestion Solution có thể thay đổi theo từng loại mẫu khác nhau).



Bước 3. Loại bỏ cặn xương bằng cách ly tâm ở 5000v/phút trong 5 phút Chuyển dịch nổi sang ống 15ml mới.

Bước 4. Thêm 2 lần thể tích Lysis Buffer.

Bước 5. Bổ sung 15µl Resin (Lưu ý: Lắc nhẹ nhàng DNA IQ™ Resin khoảng 10 giây ở tốc độ cao tới khi dung dịch tan đều mới sử dụng).

Bước 6. Vortex hỗn hợp trên khoảng 5 giây ở tốc độ cao.

Bước 7. Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút và lắc từ 1-3 lần.

Bước 8. Vortex hỗn hợp trên khoảng 5 giây ở tốc độ cao, và đặt ngay ống vào giá từ tính. Cẩn thận loại bỏ dung dịch nổi, giữ lại cặn Resin.

Bước 9. Thêm 100µl Lysis Buffer, vortex khoảng 2 giây ở tốc độ cao. Cẩn thận chuyển sang ống li tâm 1,5ml, đảm bảo lượng Resin được chuyển toàn bộ.

Bước 10. Vortex khoảng 2 giây ở tốc độ cao, đặt ống trở lại giá từ và cẩn thận loại bỏ dịch nổi.

Bước 11. Thêm 100µl 1X Wash Buffer bỏ ống ra khỏi giá từ tính và Vortex khoảng 2 giây ở tốc độ cao.

Bước 12. Đưa ống trở lại giá từ tính và loại bỏ đệm rửa.

Bước 13. Lặp lại bước 11 và 12 từ 2-3 lần.

Bước 14. Để ống nguyên trên giá từ tính và mở nắp để khô tự nhiên trong 5 phút (không để lâu quá 20 phút).

Bước 15. Thêm vào 25–100µl Elution Buffer.

Bước 16. Đóng nắp lại và vortex khoảng 2 giây ở tốc độ cao, đặt ống ở nhiệt độ 65°C trong 5 phút.

Bước 17. Vortex khoảng 2 giây ở tốc độ cao, đặt ống trở lại giá từ ngay lập tức

Bước 18. Chuyển toàn bộ dung dịch sang ống 1,5ml mới (bảo quản ADN ở -20oC)

c) Định lượng ADN: Điện di agarose kiểm tra nồng độ ADN : ADN được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm bằng Ethidium Bromide:



- Chuẩn bị agarose gel 2 % (100 ml TBE buffer 1X+ 2 gram agarose).

- Ngâm agarose trong đệm TBE 1 X trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Đun sôi trong lò vi sóng, sôi 1 phút cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

- Đưa cốc agarose ra khỏi lò vi sóng, lắc kỹ. Để nguội còn 50-60oC.

- Đổ agarose vào khuôn, tạo giếng bằng lược 4 mm, để gel đông lại.

- Tra hỗn hợp 5 - 7ml mẫu + 2 ml loading dye vào giếng.

- Chạy điện di gel trong 1X TBE buffer.

- Điện di sao cho ADN di động theo chiều từ cực âm đến cực dương (6 V/cm theo khoảng cách giữa hai điện cực).

- Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel.

(Có thể định lượng ADN khuôn bằng Realtime – PCR hoặc đo OD)

3. Phản ứng PCR

a) Khuếch đại gen: Sau khi tách chiết AND ti thể, kiểm tra nồng độ ADN, tiến hành phản ứng PCR bằng cặp các mồi trên 2 vùng siêu biến HVI, HVII của ADN ti thể:


Tên mồi

Khuếch đại vùng siêu biến

Trình tự mồi


F15971

HVI

5’-TTA ACT CCA CCA TTA GCA CC-3’

R16391

HVI

5’-GAG GAT GGT GGT CAA GGG AC-3’

F15

HVII

5’-CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG-3’

R408

HVII

5’-ATT ATT TAT CGC ACC TAC GT-3’

b) Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR.

Chu trình nhiệt được thực hiện dùng cho máy PCR (Eppendorf-Đức).



Biến tính

35 chu kỳ

Kéo dài

Kết thúc

95oC/5 phút

94oC/20 giây

61oC/30 giây

72oC/30 giây

72oC/10 phút



4oC/ ∞

c) Đối với những mẫu xương lâu năm, ADN ti thể bị phân hủy thành những đoạn ngắn thì có thể sử dụng thêm những cặp mồi khác để phân tích những đoạn gen ngắn hơn sau đây:

Tên mồi

Vùng

Kích thước

Ta

F15997 - R16236

HV1A

278bp

51.28

F16159 - R16401

HV1B

281bp

51.28

F6 - R285

HV2A

301bp

53.77

F172 - R408

HV2B

278bp

49.75

Chu trình nhiệt:



Biến tính

36 chu kỳ

Kéo dài

Kết thúc

95oC/11 phút

95oC/1 phút

55oC/1 phút

72oC/1 phút

72oC/10 phút



4oC/ ∞

4. Giải trình tự

a) Tinh sạch sản phẩm PCR:

Có thể sử dụng các kits tinh sạch sản phẩm PCR của các hãng khác nhau như: USB - Mỹ, Promega- Mỹ, Qiagen - Đức, Invitrogen - Mỹ, Fermentas - Đức, v.v…

Hiện tại, chúng tôi khuyến cáo sử dụng ExoSAP-IT của hãng USB để đảm bảo độ tinh sạch cần thiết với thời gian ngắn, tiện lợi.

Qui trình tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng ExSAP-IT:

Bước 1. Trộn 5µl sản phẩm PCR với 2µl ExoSAP-IT.

Bước 2. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 15 phút.

Bước 3. Ủ ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút.

Sản phẩm PCR này được sử dụng cho giải trình tự nucleotide, phân tích SNP.

(Bảo quản ở nhiệt độ -20oC).

b) Xác định trình tự nucleotide:

Chạy PCR có BigDye với mồi đơn




Thành phần

Thể tích (µl)

BigDye terminator RR mix

4µl

3.2 pmole primer (R hoặc F)

1µl

ADN đã tinh sạch

5µl

Tổng

10 µl

Chu trình nhiệt chạy PCR:



Biến tính

25 chu kỳ

Kéo dài

Kết thúc

92oC/2 phút

94oC/10 giây

50oC/5 giây

60oC/4 phút

60oC/7 phút



4oC/∞

Tinh sạch cho sequencing với DyeEx 2.0 Spin kits.

Bước 1. Nhẹ nhàng xoáy cột để các dung dịch gel bên trong hướng xuống phần đáy, nới lỏng nắp các cột để tránh chân không

Bước 2. Đóng cửa cuối cùng của cột xoay (spin column) và dặt cột xoay này (spin column) vào ống 2ml.

Bước 3. Ly tâm ở tốc độ tính toán (thường là 3.000 v/phút) trong 3 phút.

Bước 4. Chuyển cẩn thận sản phẩm chạy Sequencing sang cột xoay (Spin column) tránh tiếp xúc với dung dịch gel trong cột, chuyển cột xoay này sang ống eppendorf 1.5ml.

Bước 5. Ly tâm ở tốc độ tính toán (thường là 3.000 v/phút) trong 3 phút.

Bước 6. Loại bỏ cột xoay (Spin column) và lấy dung dịch trong ống 1,5ml dùng cho việc chạy sequencing trên máy giải trình tự.

Thực hiện Sequencing trên một trong các máy giải trình tự: ABI PRISM 310 Analyzer, ABI PRISM 3100/3100-Avant Analyzer, ABI PRISM 3130/3130xl Analyzer, Beckman Coµl ter -CEQ 8000, vv...

c) Phân tích gen

Sau khi trình tự nucleotide của các mẫu sinh phẩm đã được xác định, sử dụng các phần mềm chuyên dụng SequencherTM, version 5.0, Gene Codes Corporation software để so sánh, phân tích nhằm xác định mối liên quan di truyền của các mẫu.

5. Phân tích kết quả

a) Thông số kỹ thuật



Stt

Mẫu phân tích

Vùng HVI, HVII

Trình tự đọc được

Ghi chú

1













2













3













4













b) Phân tích kết quả

Đối chiếu trình tự thu được với trình tự chuẩn trên Ngân hàng Gen quốc tế rCRS (Cambridge Reference Sequence - Anderson, 2005) và so sánh các trình tự nucleotide thu được với nhau.



Stt

Vị trí

rCRS

Mẫu 1

Mẫu 2

Ghi chú

1
















2
















3
















4
















5
















...
















VII. Kết luận giám định

Kết luận giám định dựa trên kết quả phân tích.

- Đọc và so sánh các trình tự gen.

- Kết luận giám định theo mẫu số 7a hoặc 7b ban hành kèm theo Thông tư này.



VIII. Kết thúc giám định

- In, duyệt và ký đóng dấu bản kết luận giám định.

- Giao nhận bản kết luận giám định.

- Lưu hồ sơ.




tải về 3.21 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   ...   60   61   62   63   64   65   66   67   ...   78




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©tieuluan.info 2023
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương