Cộng hoà XÃ HỘi chủ nghĩa việt nam


GIÁM ĐỊNH ADN ĐỐI VỚI MẪU MÔ



tải về 3.21 Mb.
trang59/78
Chuyển đổi dữ liệu14.11.2017
Kích3.21 Mb.
#1729
1   ...   55   56   57   58   59   60   61   62   ...   78

GIÁM ĐỊNH ADN ĐỐI VỚI MẪU MÔ



I. Đối tượng và phạm vi áp dụng

Áp dụng cho tổ chức, cá nhân thực hiện giám định pháp y trên toàn quốc.



II. Hồ sơ giám định

Nhận hồ sơ từ người trưng cầu, yêu cầu giám định trực tiếp hoặc gián tiếp qua đường bưu điện, gồm:

- Quyết định trưng cầu, yêu cầu giám định hợp pháp.

- Các tài liệu khác có liên quan.



III. Nghiên cứu hồ sơ

- Nghiên cứu hồ sơ, đối chiếu với nội dung trung cầu, yêu cầu giám định.

- Tính pháp lý của hồ sơ giám định, những tài liệu cần bổ sung.

IV. Quyết định hay từ chối giám định

- Thực hiện giám định: nếu thấy đủ điều kiện cần thiết để thực hiện giám định theo nội dung trưng cầu, yêu cầu giám định hoặc yêu cầu giám định của cá nhân, tổ chức.

- Từ chối giám định trong những trường hợp sau đây:

+ Quyết định trưng cầu, yêu cầu giám định không đủ tính pháp lý

+ Yêu cầu của cơ quan giám định không được đáp ứng.

+ Nội dung trưng cầu, yêu cầu giám định vượt quá giới hạn về chuyên môn, cán bộ, phương tiện, thời gian.

- Từ chối giám định bằng văn bản và nêu rõ lý do.



V. Chuẩn bị giám định

1. Cán bộ chuyên môn

- Giám định viên: 02 người

- Người giúp việc: 02 người

2. Phương tiện

- Dụng cụ thu mẫu: kẹp, túi hoặc lọ đựng mẫu, găng tay, khẩu trang, v.v...

- Trang thiết bị: Hệ thống máy giải trình tự gen, máy luân nhiệt (PCR), máy Realtime PCR, máy chụp ảnh gel, máy điện di, máy ly tâm eppendorf 10.000, máy ly tâm lạnh, máy lắc có điều chỉnh nhiệt độ, máy khuấy từ, máy trộn vortex, máy đo pH, cân điện, tủ lạnh 40C, -200C và -800C, tủ sấy, tủ an toàn sinh học, máy cất nước 1 lần, máy cất nước 2 lần, máy sấy, các loại pipet tự động, v.v...

- Hóa chất: Các bộ kít dùng cho tách chiết ADN, kít PCR, kít tinh sạch, giải trình tự gen, điện di, các loại hóa chất cần thiết cho từng công đoạn phân tích, v.v...

- Vật tư tiêu hao: Các loại ống nghiệm, đầu côn, găng tay, khẩu trang, quần áo bảo hộ, kính bảo hộ, cồn, giấy, nước cất khử ion, v.v...

- Phương tiện khác: máy ảnh, máy vi tính, máy in, máy scan, v.v...



VI. Các bước giám định

1. Thu mẫu mô

a) Mẫu do cơ quan trưng cầu gửi đến

- Đeo găng tay, khẩu trang.

- Ghi nhận tình trạng bảo quản mẫu.

- Kiểm tra niêm phong.

- Chụp ảnh mẫu còn nguyên niêm phong.

- Mở niêm phong.

- Kiểm tra mẫu: loại mẫu, số lượng mẫu, tình trạng mẫu.

- Chụp ảnh mẫu.

- Lập biên bản giao nhận mẫu theo qui định.

b) Mẫu thu trực tiếp tại hiện trường



Bước 1: Chuẩn bị: Đeo găng tay, khẩu trang, tuýp đựng mẫu, vv …

Bước 2. Ghi ký hiệu, vị trí thu mẫu bên ngoài tuýp đựng mẫu.

Bước 3. Chụp ảnh mẫu.

Bước 4: Dùng panh hoặc kẹp thu mẫu mô.

Bước 5. Cho mẫu vào tuýp đựng và bảo quản theo quy định.

Bước 6. Lập biên bản thu mẫu theo qui định.

2. Tách chiết ADN từ mẫu mô

a) Tách chiết ADN bằng QIAamp® DNA mini kits:

Bước 1. Trích < 10 mg mẫu mô cho vào ống eppendorf 1.5 ml.

Bước 2. Cho 180 l Buffer ATL vào ống, để ở to 15-25 oC .

Bước 3. Cho thêm 20 l proteinase K, vortex khoảng 15 giây.

Bước 4. Cho ống nghiệm vào máy ổn nhiệt ở 56 oC qua đêm đến khi mẫu ly giải hoàn toàn.

Bước 5. Bổ sung thêm 200 l AL, vortex khoảng 15 giây.

Bước 6. Cho thêm 200 l cồn tuyệt đối, vortex khoảng 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng 15-25 oC trong 5 phút.

Bước 7. Ly tâm nhanh.

Bước 8. Chuyển toàn bộ dung dịch ly giải sang cột QIAamp MinElute (trong ống 2 ml). Ly tâm 8000 vòng/phút. Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác. Loại bỏ ống chứa dịch.

Bước 9. Cho thêm 500 l Buffer AW1. Ly tâm 8000 vòng/phút. Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác. Loại bỏ ống chứa dịch.

Bước 10. Cho thêm 500 l Buffer AW2. Ly tâm 8000 vòng/phút. Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác. Loại bỏ ống chứa dịch.

Bước 11. Ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3 phút và để khô hoàn toàn.

Bước 12. Đặt cột vào ống 1,5 ml. Loại bỏ ống chứa dịch. Cho thêm từ 20-100 l dung dịch AE vào giữa trung tâm màng lọc.

Bước 13. Đậy nắp, để ở nhiệt độ phòng (15-25 oC) trong 1- 5 phút. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút.

Bước 14. Điện di agarose kiểm tra nồng độ ADN.

ADN được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm bằng Ethidium Bromide hoặc Red-Safe:



- Chuẩn bị agarose gel 2 % (100 ml TBE buffer 1X+ 2 gram agarose).

- Ngâm agarose trong đệm TBE 1 X trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Đun sôi trong lò vi sóng, sôi 1 phút cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

- Đưa cốc agarose ra khỏi lò vi sóng, lắc kỹ. Để nguội còn 50-60o C.

- Đổ agarose vào khuôn, tạo giếng bằng lược 4 mm, để gel đông lại.

- Tra hỗn hợp 5-7 l mẫu + 2 l loading dye vào giếng.

- Chạy điện di gel trong 1X TBE buffer.

- Điện di sao cho ADN di động theo chiều từ cực âm đến cực dương (6 V/cm theo khoảng cách giữa hai điện cực).

(Có thể định lượng ADN khuôn bằng Realtime – PCR hoặc đo OD).

b) Tách chiết ADN bằng các kít khác cần tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất.

3. Phản ứng PCR

a) Đối với PowerPlex® 16 kits

a1) Thành phần phản ứng PCR với PowerPlex® 16 kits



Thành phần phản ứng PCR

Thể tích (µl) x Số phản ứng = Tổng thể tích

Nước cất khử ion

9.2 x =

Đệm Gold Star 10X

2.5 x =

PowerPlex 16 Primer mix 10X

2.5 x =

AmpliTaq Gold ADN polymerase

0.8 (4 unit) x =

ADN khuôn (2-10ng) (*) + thêm nước cất khử ion vừa đủ

10

Tổng thể tích

25

(*) Tùy thuộc vào lượng ADN khuôn, điểu chỉnh thêm nước cất cho vửa đủ 10 µl.

Chứng dương =1ng of 9947A DNA hoặc K562 DNA

Chứng âm= Nước cất khử ion







a2) Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với PowerPlex® 16 kits

(Áp dụng cho máy PCR Gene Amp PCR System 9700 Thermal Cyler)



[95°C/11 phút][96°C/1phút]







[94°C/30 giây, 60°C/30 giây, 70°C/45 giây] 10 chu kỳ

[90°C/30 giây, 60°C/30 giây, 70°C/45 giây] 18-22 chu kỳ

[60°C/45 phút]

[4°C/∞]








* Đối với máy PCR khác có thể tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất bộ kít.

b) Đối với Identifiler® kits

b1) Thành phần phản ứng PCR với Identifiler® kits của hãng ABI

(AmpFlSTR Profiler, AmpFlSTR Profiler Plus, AmpFlSTR Identifiler)



Thành phần phản ứng PCR

Thể tích (µl) x Số phản ứng = Tổng thể tích

PCR Reaction Mix

10.5 x =

Identifiler® Primer Set

5.5 x =

AmpliTaq Gold® DNA Polymerase

0.5 x =

ADN khuôn (2-10ng) (*) + Nước cất khử ion vừa đủ

8.5

Tổng thể tích

25

(*) Tùy thuộc vào lượng ADN khuôn, điểu chỉnh thêm nước cất cho vửa đủ 8.5 µl.

Chứng dương =1ng 9947A DNA hoặc K562 DNA

Chứng âm= Nước cất khử ion







b) Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với với Identifiler® kits

(Áp dụng cho máy PCR Gene Amp PCR System 9700 Thermal Cyler)



[95°C/11 phút]







[94°C/1phút, 59°C/1phút, 72°C/1phút] 28 chu kỳ

[60°C/45phút]

[4°C/∞]





* Đối với máy PCR khác có thể tham khảo thêm hướng dẫn của hãng sản xuất bộ kít.

** Đối với một số loại kít khác có trên 16 locus có thể sử dụng, tham khảo tiêu chuẩn kỹ thuật và hướng dẫn sử dụng của nhà sản suất.

4. Điện di

Trước khi điện di mao quản, sản phẩm PCR cần pha loãng để lấy 1 µl. Chuẩn bị mẫu điện di:

a) Đối với sản phẩm PCR theo PowerPlex® 16 kits


Thành phần

Thể tích (µl)

Số mẫu

Tổng thể tích

ILS-600

0,5







Hi-Di Formamide

9,5







Sản phẩm PCR đã pha loãng

1,0







Tổng

11







Allelic ladder : 1.0 µl allelic ladder + ILS-600- Formamid mix 10 µl

Đối với mẫu trắng (blank): 10 µl Hi-Di Formamide

b) Đối với sản phẩm PCR theo Identifiler® kits


 Thành phần

Thể tích (µl)

Số mẫu

Tổng thể tích

LIZ-500

0,3




 

Hi-Di Formamide

8,7




 

Sản phẩm PCR pha loãng

1,0




 

Tổng

10







Allelic ladder: 1.0 µl allelic ladder + LIZ-500 - Formamid mix 9.0 µl

Đối với mẫu trắng (blank), cho 10 μL Hi-Di™ Formamide.

Các mẫu chuẩn bị được sốc ở nhiệt độ 95oC, trong 3 phút. Sau đó chuyển ngay lập tức vào đá lạnh để biến tính 3 phút và chạy trên máy phân tích.

Bảo quản mẫu sau khi chạy phân tích đoạn ở nhiệt độ -20o C.



* Đối với một số loại kít khác có thể sử dụng, tham khảo tiêu chuẩn kỹ thuật và hướng dẫn sử dụng của nhà sản suất.

5. Phân tích kết quả



(Bảng các locus phân tích thuộc bộ PowerPlex®16 kits và Identifiler kít)

STR locus

Alen (Mẫu 1)

Alen (Mẫu 2)

Alen (Mẫu 3)

Penta E










D18S51










D21S11










TH01










D3S1358










FGA










TPOX










D8S1179










vWA










Amelogenin










Penta D










CSF1PO










D16S539










D7S820










D13S317










D5S818










D2S1338










D19S433










VII. Kết luận giám định

Kết luận giám định dựa trên kết quả phân tích.

- Đọc và so sánh các locus gen.

- Tính xác suất, độ tin cậy.

- Kết luận giám định theo mẫu số 7a hoặc 7b ban hành kèm theo Thông tư này.

VIII. Kết thúc giám định

- In, duyệt và ký, đóng dấu bản kết luận giám định.

- Giao nhận bản kết luận giám định.

- Lưu hồ sơ.




tải về 3.21 Mb.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:
1   ...   55   56   57   58   59   60   61   62   ...   78




Cơ sở dữ liệu được bảo vệ bởi bản quyền ©tieuluan.info 2022
được sử dụng cho việc quản lý

    Quê hương